培養基的制備、使用、保存及相關疑難解答

　　一、培養基的實驗室制備

　　確制備培養基時微生物檢驗的最基礎步驟之一。使用脫水培養基和其他成分，尤其是含有有毒物質(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應遵守良好實驗室規范和生產廠商提供的使用說明。培養基的不正確制備會導致培養基出現質量問題。

　　使用商品化脫水合成培養基制備培養基時，應嚴格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關數據，如質量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。

　　使用各別成分制備培養基時,應按照配方準確配制,記錄所有細節信息,如;培養基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質含量、制造商、批號、pH、培養基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。

　　1.水

　　除特定要求,實驗室用水的電導率在25℃下應不高于25uS/cm(相當于電阻率≥0.4MΩcm)。

　　微生物污染應不超過103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。應根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的污染。

　　2.稱量和復水

　　稱量所需量的脫水培養基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質的培養基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養基結塊)后再加水至所需的量。

　　3.溶解和分裝

　　脫水培養基加水后適當加熱,并不攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養基在加熱溶解前應浸泡幾分鐘。

　　4.pH的測定和調整

　　用pH計測定pH,必要時在滅菌前調節pH，除特殊說明外,培養基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的氫氧-化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液調節pH。如果滅菌后調節pH，溶液需滅菌。

　　注:商品化培養基在高壓滅菌前后pH可能發生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調節pH。

　　5.分裝

　　將配置好的培養基分裝到適當的容器中，容器的體積至少為體積的1.2倍。

　　6.滅菌

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　　培養基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。

　　有些培養基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養基對光和熱特別敏感，應在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需要滅菌，直接使用(參見相關標準或生產廠商的使用說明)。

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　　濕熱滅菌在高壓鍋或培養基制備器中進行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養基的體積超過1000mL，要對滅菌條件進行適當的調整。所有操作均要按照標準和使用說明的規定進行。

　　注：大容量培養基(>1000mL)滅菌時可能會造成過度加熱。

　　加熱后應采取適當的方式冷卻，防止沸溢。這對大容量培養基和敏感性培養基(如含亮綠的培養基)是非常重要的。

　?、圻^濾滅菌

　　過濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進行。使用無菌設備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預消毒設備。

　　一些濾膜上附著蛋白質或其他物質(如抗生素)。為達到有效過濾,應事先將濾膜用無菌水潤濕。

　?、鼙O測

　　應對經濕熱或過濾滅菌的培養基進行監測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進行監測。

　　7.添加劑的制備

　　制備含有有毒物質(特別是抗生素)時應小心操作，避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發生其他不良反應。采用適當的預防措施并小心按照產品使用說明操作。不要使用過期的試劑;抗生素工作溶液現配現用;批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應提供冷凍對抗生素活性影響的相關資料，也可由使用者自行測定。

　　二、培養基的使用

　　1.瓊脂培養基的融化

　　將培養基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經過高壓滅菌的培養基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養基融化后立即移開,室溫靜置片刻(約2min)，以免玻璃容器發生破裂。

　　融化后的培養基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫，冷卻到47℃~50℃所需的時間取決于培養基的類型、體積和在水鍋里的分裝量。融化后內培養基應盡快使用，放置時間一般不超過4h。剩余的培養基固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養基，應根據相關標準，縮短融化后放置的時間。

　　將瓊脂培養基倒入類似檢測培養使用的獨立容器中,插入溫度計,記錄并保存瓊脂的融化溫度。

　　加入樣品的培養基應將溫度調節到44℃~47℃，或按照相關標準調節溫度。

　　2.培養基的脫氣

　　必要時，在使用前將養基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器蓋子;加熱后蓋緊蓋子，并迅速冷卻至使用溫度。

　　3.添加成分的加入

　　對熱不穩定的添加成分應在培養基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養基并充分混勻，盡快分裝到待用的容器中。

　　4.培養基的棄置

　　所有污染和未使用的培養基的棄置應采用安全的方式,并符合相關法律法規的規定。

　　三、平板的制備和儲存

　　傾注融化后的培養基到平皿中,使之在乎皿中形成一個至少3mm厚度的瓊脂層(直經90mm的平皿通常要加入18mL-20mL瓊脂培養基),或根據相關標準要求制備平皿。將平皿蓋好皿蓋后放置在水平平面使指冷卻凝固。如果平板要儲存、培養時間超過48h或培養溫度超過40℃，要增加培養基的傾注量。

　　注：在培養過程中,瓊脂培養基會損失水分,在某些環境條件下會影響微生物的生長。,造成培養基水分損失的因素很多,如培養基的成分、平皿中培養基的量、培養箱的類型(如使用帶風扇的培養箱)、培養箱里的空氣濕度、平皿在培養箱中放置的位置和數量以及培養溫度等。

　　凝固后的培養基應立即使用或存放在防止其成分發生變化的條件下,如存放于暗處和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或側面做好標記,標記的內容包括培養基名稱、制備日期和(或)有效期,也可使用適宜的培養基編碼系統進行標記。

　　將傾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延長儲存期限。為了避免冷凝水的產生,平板應冷卻后再裝入密封袋中。貯存前不要對培養基表面進行干燥處理。

　　對于采用表面接種的固體培養基,應先對瓊脂表面進行干燥：揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱/培養箱中(溫度設置為25℃~50℃);或放在有對流風的無菌凈化臺中,直到培養基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥。商業化的平板脂培養基應按照廠商提供的說明使用。

　　四、疑難解答

　　1.培養基不能凝固

　?、倥囵B基制備過程中過度加熱

　?、诘蚿H值造成培養基酸解

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　?、菖囵B基成分未充分混勻

　　2.pH值不正確

　?、倥囵B基制備過程中過度加熱

　?、谒|不佳

　?、弁獠炕瘜W物質污染

　?、茉诓徽_溫度下測量pH值

　?、輕H計未正確校準

　?、廾撍囵B基質量差

　　3.顏色異常

　?、倥囵B基制備過程中過度加

　?、谒|不佳

　?、勖撍囵B基質量差

　?、躳H值不正確

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　　4.產生沉淀

　?、倥囵B基制備過程中過度加熱

　?、谒|不佳

　?、勖撍囵B基質量差

　?、躳H值未正確控制

　?、萑绻歉鲃e成分制備的培養基---原材料不純

　　5.培養基出現抑制/生長率低

　?、倥囵B基制備過程中過度加熱

　?、谒|不佳

　?、勖撍囵B基質量差

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　?、萏砑映煞植徽_，如加入添加成分時培養基過熱或添加濃度錯誤

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　　6.污染

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　?、跓o菌操作有誤

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